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PCR 引物設(shè)計的十個基本原則
發(fā)表時間：2024-07-03
PCR 引物設(shè)計的十個基本原則：
1、引物zuì好在模板 cDNA 的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計：
DNA 序列的保守區(qū)是通過物種間相似序列的比較確定的。搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟件比對，各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)。
2、引物長度一般在15~30堿基之間：
引物長度(primer length)常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA 聚合酶進行反應(yīng)。
3、引物 GC 含量在 40%~60% 之間，Tm值zuì好接近 72℃：
上下游引物的 Tm 值是寡核苷酸的解鏈溫度。有效啟動溫度，一般高于 Tm 值 5~10℃，其 Tm 值zuì好接近 72℃ 以使復(fù)性條件zuì佳。
4、引物 3′ 端要避開密碼子的第 3 位：
如擴增編碼區(qū)域，引物 3′ 端不要終止于密碼子的第 3 位，因密碼子的第 3 位易發(fā)生簡并，會影響擴增的特異性與效率。
5、引物 3′ 端不能選擇 A，zuì好選擇 T：
當末位鏈為 T 時，錯配的引發(fā)效率大大降低，G、C 錯配的引發(fā)效率介于 A、T 之間，所以 3′ 端zuì好選擇 T 。
6、堿基要隨機分布：
降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布zuì好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
7、引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補序列：
引物自身不應(yīng)存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Hairpin)使引物本身復(fù)性。
8、引物的 5′ 端可以修飾，而 3′ 端不可修飾：
引物 5′ 端修飾包括：加酶切位點；標記生物su、熒光、di高辛、Eu3+等，引物的延伸是從 3′ 端開始的，不能進行任何修飾。
9、擴增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級結(jié)構(gòu)：
某些引物無效的主要原因是擴增產(chǎn)物單鏈二級結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴增片段時zuì好避開二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。
10、引物應(yīng)具有特異性：
引物設(shè)計完成以后，應(yīng)對其進行 BLAST 檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進行下一步的實驗了。
1、引物zuì好在模板 cDNA 的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計：
DNA 序列的保守區(qū)是通過物種間相似序列的比較確定的。搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟件比對，各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)。
2、引物長度一般在15~30堿基之間：
引物長度(primer length)常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA 聚合酶進行反應(yīng)。
3、引物 GC 含量在 40%~60% 之間，Tm值zuì好接近 72℃：
上下游引物的 Tm 值是寡核苷酸的解鏈溫度。有效啟動溫度，一般高于 Tm 值 5~10℃，其 Tm 值zuì好接近 72℃ 以使復(fù)性條件zuì佳。
4、引物 3′ 端要避開密碼子的第 3 位：
如擴增編碼區(qū)域，引物 3′ 端不要終止于密碼子的第 3 位，因密碼子的第 3 位易發(fā)生簡并，會影響擴增的特異性與效率。
5、引物 3′ 端不能選擇 A，zuì好選擇 T：
當末位鏈為 T 時，錯配的引發(fā)效率大大降低，G、C 錯配的引發(fā)效率介于 A、T 之間，所以 3′ 端zuì好選擇 T 。
6、堿基要隨機分布：
降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布zuì好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
7、引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補序列：
引物自身不應(yīng)存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Hairpin)使引物本身復(fù)性。
8、引物的 5′ 端可以修飾，而 3′ 端不可修飾：
引物 5′ 端修飾包括：加酶切位點；標記生物su、熒光、di高辛、Eu3+等，引物的延伸是從 3′ 端開始的，不能進行任何修飾。
9、擴增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級結(jié)構(gòu)：
某些引物無效的主要原因是擴增產(chǎn)物單鏈二級結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴增片段時zuì好避開二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。
10、引物應(yīng)具有特異性：
引物設(shè)計完成以后，應(yīng)對其進行 BLAST 檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進行下一步的實驗了。
